Amikor Thurzó György, elkötelezett protestáns után (+1616) Forgách Zsigmondot választják meg nádorrá, aki átlépett a katolikus hitre, megnyílt az út az ellenreformáció előtt. A Bethlen Gábor vezette további három rendi felkelés, melyet szinte az egész ország támogatott, hatalmas katonai sikereket hozott. Pozsonyi bevonulásának eredményeként 1619-ben a Szent Márton templom a protestáns többség használatába került, mivel a katolikusoknak még két templomuk volt. Ez azonban csak 1621-ig tartott, amikor is elveszítették a jogot, hogy istentiszteleteiket a dómban tarthassák.
Az evangélikusok óhaja, hogy saját templomuk legyen, nem lankadt, mivel a városlakók többsége még mindig evangélikus volt, és az Armpruster-ház már ugyancsak szűknek bizonyult. Így a városi tanács, mely többségében szintén protestáns volt, 1634-ben kérvényezte saját templom építését a technikailag és befogadóképesség szempontjából nem megfelelő Armpruster-ház helyett. A vallásszabadságot lehetővé tevő békeszerződésekre hivatkoztak, főként az 1606-ban létrejött bécsi békére, mely egyenlő jogokat biztosított a katolikusok és a protestánsok számára. Nem sorolhatjuk fel mindazt a gáncsoskodást, amivel az ellenzők éltek, de végül 1636. március 31-én az uralkodó engedélyezte, „hogy a luteránusok felépíthetik a templomot”. Így 1636. május 19-én, Szentháromság ünnepén letették az alapkövet. Ebben az évben gyűjtést rendeztek, és minden család nagyvonalúan adakozott, ahogy erről a feljegyzések tanúskodnak. Rövidesen azonban Pálffy nádor egy hónapra leállíttatta az építkezést. Sem a nádorhoz járult tanácsosok és papok deputációi, sem a már beteg uralkodóhoz intézett újabb és újabb könyörgő levelek nem jártak eredménnyel. II. Ferdinád februárban meghalt, két hónap múlva elhunyt Pázmány Péter érsek is, és a pozsonyiak gyors ütemben folytatták az építkezést. A nádor és az egyházközség közti harc csak az 1637. szeptember 21-én kezdődő országgyűlés idején csitult el, mivel az új király, III. Ferdinánd tudatosította, hogy szüksége lesz a protestánsokra. Úgyhogy az építkezés az országgyűlés ideje alatt is folytatódott.
A templom befejezését ugyan engedélyezték, de a nádor kikötötte, hogy nem lehet tornya, és a bejárat és az ablaknyílások nem lehetnek félkörívesek, hanem négyszögletesek, hogy ne emlékeztessenek templomi ablakokra. Végül még az épület addig kifogásolt magasságát is jóváhagyták, mivel az nem nőtte túl a környező házakat.
Az építészeknek számtalan korlátozással kellett megalkudniuk, mégis ez az építmény az első új, reneszánsz stílusban épült szakrális alkotás nálunk.
A reneszánsz építészet jellegzetesen emberközpontú. A templom alaprajza így egyszerű, téglalap alakú, amit egyenlő magasságban keresztboltozat fed. A boltozatot oszlopsor támasztja alá, s ezeken három oldaról nyugszik a karzat, hogy minél több hívő vehessen részt az istentiszteleten. Már nem a magasba törő gótikus belső, a meditatív homály, de a széles, csarnokszerű tér a jellemző, amit tökéletesen bevilágít a homlokzati részen levő négy nagy ablak és az oldalfalakon levő, két emeleten át húzódó, öt-öt ablak. Ez a fajta emeletes megoldás először jelenik meg, a belső karzatokat jelzi, melyek ezentúl az evangélikus templomok jellemző jegyeivé váltak. Az írástudás, a prédikáció hangsúlyozása, a nemzeti nyelvekre való bibliafordítás, az a törekvés, hogy az evangéliumot önálló tanulmányozással is megérthesse az ember, ez volt a reformáció célkitűzése, s ehhez sok fényre volt szükség.
Az épület tervezőjét nem ismerjük, de fennmaradt Windisch ács neve, aki 1637 októberében felépítette a templom tetőzetét. A következő évben, 1638. december 18-án a pozsonyi pap és esperes Jozua Wegelin köszönetet mondott az elkészült műre. A templomavatási ünnep 2 nappal később volt, és a Szentháromság-templom nevet kapta.
A 17. század 40-es éveiben az egyházközség tagjainak száma 15 000 körül volt, évente körülbelül 300 házasságot kötöttek, Úrvacsorakor az oltáron a sok résztvevő miatt 12 kehely és 6 kancsó sorakozott – az egyházközség tagjainak ajándékai. Ugyancsak a céhek és a gazdag polgárok ajándéka volt az orgona, az oltár és a templom egyéb berendezési tárgyai.
Örömöt és lelkesedést váltott ki az is, hogy a templomi zene nagy dicsőséget szerzett az olyan ismert orgonisták – zeneszerzők működése által, mint Samuel Capricornus és Johann Kusser.
A Pozsonyban 1672 tavaszán történtek egy akciófilm forgatókönyvéhez hasonlítanak:
Szelepcsényi érsek követelte a templomok és az iskola kulcsait. A rendíthetetlen Segner városbíró már nem élt, de a polgárok saját testükkel védték templomaikat az elvételükre küldött várőrséggel szemben. A jezsuiták által nevelt katolikus ifjúság be akart hatolni a gimnáziumba, de sikertelenül, az iskolát az asszonyok megvédték. S mindezt Szelepcsényi a városháza ablakából nézte.
Szelepcsényi dühös igyekezete eleinte nem járt sikerrel, erőszakhoz kellett folyamodnia. Hogy ne riassza a polgárokat, a 4 regiment katona Nigrelli tiszt vezetésével április 10-én, Virágvasárnap, akkor érkezett a városba, amikor az evangélikusok istentiszteleten voltak. Lefegyverezték a Mihály és a Lőrinc kapu őrségét, és elvették a kulcsaikat. Felsorakoztak a Főtéren és elfoglalták az összes városkaput.
Április 24-e Pozsonyban a városi tanácsba való választás napja volt. De mivel a városházát is elfoglalták a katonák, a választást nem lehetett megtartani.
Májusban Szelepcsényi rendkívüli bírósági tárgyalást szervezett Nagyszombatban, melyre beidéztette mind a négy pozsonyi evangélikus papot, Titius David esperest is, valamint a város összes jelentős polgárát. Az idézettek száma 320 körül volt. Június 3-án hirdettek ítéletet, mely fej-, jószág- és becsületvesztés volt.
Szelepcsényi úgy tervezte felszámolni az evangélikus egyházat, hogy elveszi templomait, iskoláit, a papokat és a polgárokat pedig rákényszeríti aláírni a reverzálist.
A városba eközben a 4 regiment mellé még két század gyalogos érkezett. Mindennek ellenére azonban a templomok és az iskola kulcsait nem sikerült szépszerével megszereznie.
Július 17-én Kollonich háza elé egy lorettói Mária kép és gyertya volt kitéve – sejtetve, hogy közeledik a végső nap.
Július 18-án már reggel 5-kor – hangos parancs- és kürtszó nélkül – sorakoztak fel Nigrelli katonái a Főtéren, a Zöld-ház és a városháza előtt, elfoglalták az evangélikus templom felé vezető utcákat, felálltak a Búza-téren – a mai Orsolya templom elé. És miután újra nem kapták meg a templomok és az iskola kulcsait, mivel Pihringer sekrestyés elutasította ezt, a katonák azt a parancsot kapták, törjék be az iskola kapuját. Ezt meg is tették, az ajtót teljesen szétrombolták, bejutottak a líceumba, s mivel ez össze volt kötve a templommal, elfoglalták azt is. Kollonich feltörette velük a perselyeket, s a benne levő pénzt jutalomként nekik adta. A teljes berendezést elkobozták. Mindkét templom kapuját fejszével szétverték. A német templomot a jezsuiták kapták meg, akik ezt már régen szorgalmazták.
A nagyszombati börtönben sínylődő papok helyzete folyton bizonytalan volt. A pozsonyiak július 31-én kijelentették, hogy örök időre elhagyják Magyarországot, s így augusztus 4-én hajnalban, katonai kíséret mellett, búcsu és anyagiak nélkül elhagyták az országot.
A város továbbra is tele volt katonasággal. Szeptember 9-ére tűzték ki a templomok felszentelését, hogy ne kerülhessenek vissza az evangélikusokhoz. Az ezüst oltár – gróf Nádassy ajándéka – és az ezüst keresztelőmedence már nem volt meg. Nevét is megváltoztatták, a szt. Margaréta nevet kapta. A másik templomot az orsolyák rendje szerezte meg. És ezzel elérkezett a sötétség ideje. 1673-ban Szelepcsényi megszervezte a hirhedt Pozsonyi vértörvényszéket, ahová egész Magyarország területéről beidézte a protestáns papokat és tanítókat, akiket elítéltek, majd gályarabságba küldtek.
A jezsuiták teljesen átalakították belül, a külső részen egyedül a kapubejárat felett elhelyezték a gazdagon díszített, sokszínű rendi jelvényüket (IHS), amelyet Johann Wüngler mester alkotott. A templom a jezsuita rend feloszlatása után, Mária Terézia vejének, Albert szász-tescheni hercegnek az udvari temploma lett, majd 1854-ben visszaadták a jezsuiták tulajdonába.